Dinámica de las células inmunes desconvolucionada por un solo

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 2285 (2023) Citar este artículo

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La perfusión con máquina normotérmica (NMP) ha surgido como una técnica innovadora de preservación de órganos. Es esencial desarrollar una comprensión de la composición de las células inmunitarias del órgano donante y sus cambios dinámicos durante la NMP. Nuestro objetivo era lograr una caracterización integral de las (sub)poblaciones de células inmunitarias, el tráfico celular y la liberación de citoquinas durante la NMP hepática. El perfil del transcriptoma unicelular de hígados de donantes humanos antes, durante la NMP y después del trasplante muestra una abundancia de neutrófilos del receptor de quimiocina CXC 1+/2+ (CXCR1+/CXCR2+), que disminuyó significativamente durante la NMP. Esto va acompañado de una gran salida de leucocitos pasajeros con predominio de neutrófilos en el perfundido. Durante la NMP, los neutrófilos cambian de un estado proinflamatorio a un fenotipo envejecido/activado crónicamente/agotado, mientras que los monocitos/macrófagos antiinflamatorios/tolerogénicos aumentan. Aquí describimos la dinámica del repertorio de células inmunes, los cambios fenotípicos de las células inmunes y el predominio de los neutrófilos durante la NMP hepática, que potencialmente contribuyen a la respuesta inflamatoria. Nuestros hallazgos pueden servir como recurso para iniciar futuros estudios de intervención inmunológica.

El trasplante de hígado (TH) es el único tratamiento definitivo para la enfermedad hepática terminal1,2,3. La escasez de órganos sigue siendo un factor limitante importante, ya que la demanda supera con creces la oferta. La necesidad de mejores tecnologías de preservación junto con mayores tasas de utilización en órganos de donantes de criterios extendidos (DCE) impulsó el desarrollo de la perfusión mecánica normotérmica (NMP). De este modo, un órgano se perfunde continuamente en condiciones casi fisiológicas a 37 °C con concentrados de eritrocitos heparinizados y oxigenados complementados con nutrición y antibióticos y en un sistema estéril cerrado. La NMP permite una evaluación integral de la calidad y función de los órganos durante la preservación ex vivo y puede servir como plataforma para el reacondicionamiento, tratamiento y reparación de órganos extracorporales2,4,5,6,7,8,9.

Se han perfundido con éxito cientos de órganos mediante máquinas y los resultados a corto plazo indican que la NMP podría ayudar a disminuir las tasas de descarte de órganos y servir para una selección adecuada de órganos aptos para trasplante4,10,11,12. Sin embargo, si bien la función general de los órganos se puede medir fácilmente, se sabe poco sobre el estado inmunológico de un órgano y sus leucocitos residentes en los tejidos durante la NMP. En estudios experimentales de perfusión pulmonar y renal ex vivo, una gran cantidad de leucocitos pasajeros se movilizan y se extravasan en el perfundido, afectando así la inmunogenicidad del injerto13,14. También se han publicado en NMP15 del hígado datos que sugieren la movilización de leucocitos pasajeros en el perfusado. Teniendo en cuenta la capacidad inflamatoria y la magnitud de las células inmunes intrínsecas del hígado, es de vital importancia una comprensión más profunda del impacto de la NMP en el estado de las células inmunes hepáticas y su dinámica durante la NMP. En este documento, se consideró que el mapeo detallado de leucocitos de pasajeros mediante la tecnología de secuenciación de ARN unicelular del transcriptoma completo (scRNASeq)16 mejoraba significativamente nuestra comprensión de los mecanismos moleculares, incluidos los circuitos inflamatorios durante la NMP hepática. En los últimos años, los estudios de scRNASeq tuvieron como objetivo evaluar la heterogeneidad celular de los hígados humanos en diversas condiciones, incluida la lesión por isquemia/reperfusión (IRI)17,18,19,20,21,22,23,24. Se aplicó un mapeo en profundidad de células inmunes en serie de ocho hígados de donantes humanos antes y al final de NMP para investigar específicamente la fuente de citocinas/quimiocinas inmunomoduladoras y la dinámica de la activación inmune a nivel unicelular. Validamos y visualizamos nuestros hallazgos mediante tinción inmunofluorescente (IF) múltiple en biopsias de hígado. La correspondiente movilización de células inmunitarias se caracterizó mediante fenotipado en muestras de perfusión en serie recolectadas durante 26 NMP de hígado humano, así como perfiles y cuantificación de citocinas.

En este trabajo, el mapeo profundo de células inmunes muestra el predominio de neutrófilos en hígados de donantes humanos, que se movilizan en la perfusión tempranamente durante la NMP hepática. La evaluación del fenotipo y la dinámica del repertorio de células inmunes hepáticas junto con los correspondientes patrones de comunicación entre células mejoran nuestra comprensión de la inmunología de los hígados normotérmicos perfundidos por máquina.

En la Tabla 1 se presenta una descripción general de la población general del estudio (los datos individuales se proporcionan en la Tabla complementaria 1). La información detallada sobre los hígados en estudio y el análisis se proporciona como esquema de flujo de trabajo en la Fig. 1. La decisión de aplicar NMP se basó en una o una combinación de las siguientes indicaciones: (D) presunta baja calidad del órgano, (R) receptor quirúrgicamente complejo y /o (L) logística (archivo de datos fuente). El tiempo de NMP dependió del tiempo requerido para la evaluación y del tiempo objetivo para la cirugía2,4,25. La mediana del tiempo de NMP fue de 19,13 h (h) (rango intercuartil (RIC) 11,56-21,64). La mediana del pico de aspartato transaminasa (AST) y alanina transaminasa (ALT) fue de 6410 U/l (RIC 2422-13696) y 3194 U/l (RIC 1402-7791), la mediana del nivel de lactato a las 6 h fue de 12 mmol/l ( RI 18-180). La decisión de trasplantar o descartar un hígado se basó en los parámetros de perfusión definidos previamente2,4,25. Siguiendo criterios predefinidos (ver métodos), se trasplantaron 24 hígados después de NMP, mientras que diez se rechazaron debido a la incapacidad de mantener los valores de pH fisiológico, la degradación inadecuada del lactato y los altos niveles de perfusión de AST/ALT.

Si bien en este estudio se incluyeron un total de 34 hígados de donantes y se sometieron a NMP, ocho de 34 hígados de donantes se seleccionaron al azar para scRNASeq y 26 de 34 para muestreo de perfusión. Además, se recolectaron muestras de tejido en los 34 hígados para evaluar y validar los hallazgos sobre el nivel de proteína. Se proporciona información sobre los momentos de muestreo, el análisis, el donante y el estado del trasplante de los órganos. FFPE fresco congelado incluido en parafina, perfusión con máquina normotérmica NMP, reperfusión RP, inmunofluorescencia IF, inmunohistoquímica IHC, donante DBD después de muerte cerebral, donante DCD después de muerte circulatoria.

La mediana del modelo de receptor para la enfermedad hepática terminal (MELD) y la puntuación del equilibrio de riesgos (BAR) fueron 14 (RIC 11-18) y 7 (RIQ 7-10). La mediana de edad del receptor fue de 60 años (RIQ 55-68). La mediana de la estancia hospitalaria en la unidad de cuidados intensivos (UCI) y total fue de 5 (RIC 3-9) y 21 días (RIC 15-30). Nueve pacientes (37%) desarrollaron disfunción temprana del aloinjerto (EAD). Se produjeron complicaciones de grado >3 de Clavien-Dindo en 11 (46%) pacientes. Tres pacientes murieron por sepsis fúngica, uno por sepsis por Clostridium difficile y uno por colangiosepsis. La supervivencia del injerto censurada por muerte fue del 100% (Tabla 2).

Como primer paso, se caracterizó el repertorio general de células inmunitarias de ocho hígados de donantes sometidos a NMP antes de NMP (T0), al final de NMP (T1) y después de la reperfusión (T2) utilizando el perfil scRNASeq (Fig. 2A). Anotamos las poblaciones celulares más relevantes mediante agrupación no supervisada (Fig. 2B). Nuestros análisis describen la composición celular y la dinámica de la expresión genética de todos los tipos de células hepáticas que componen el parénquima, incluidas las células inflamatorias del hígado. Si bien todo el conjunto de datos está disponible y el fenotipo de expresión genética y la dinámica de las células constituyentes son interesantes y relevantes, el enfoque de este estudio fueron los cambios dinámicos de las células inflamatorias hepáticas durante la perfusión ex vivo de hígados de donantes humanos.

Una descripción general del flujo de trabajo de scRNASeq. Se indican las proporciones de células epiteliales (KRT18), leucocitos (PTPRC/CD45) y células endoteliales (SPARC) en el conjunto de datos scRNASeq obtenido. B Gráfico de proyección y aproximación de variedad uniforme (UMAP) de 118.448 celdas individuales, codificadas por colores por tipo de celda. C Composición relativa del tipo de células en tejidos hepáticos de ocho pacientes individuales. Gráficos D UMAP, codificados por colores para la expresión de genes marcadores específicos del tipo de célula indicado (puntas de flecha rojas). E Niveles de expresión genética de marcadores específicos de tipo celular. F La proporción de poblaciones de leucocitos en el tejido hepático determinada por scRNASeq frente a citometría de flujo. Gráfico G UMAP coloreado por el número de transcripciones por celda. La escala de colores está recortada a 20.000. H Diagrama de caja del recuento de transcripciones por tipo de célula. Los valores indican el promedio por paciente (n = 8). La línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartil (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR.

Se analizaron genes marcadores para anotar tipos de células específicas, como neutrófilos (FCGR3B), monocitos/macrófagos (CD68), células T CD3+ (CD3E), células T CD4+ (CD4), células T CD8+ (CD8A), células T reguladoras (Tregs). ) (FOXP3), células asesinas naturales (NK) (NKG7), células dendríticas (FLT3), células progenitoras (CD24), células B (CD79A), células plasmáticas (JCHAIN), hepatocitos (ALB), células endoteliales (FLT1) y colangiocitos (KRT19; Fig. 2D, E, Fig. 2 complementaria). Para garantizar una interpretación sólida de los datos, nos centramos en las firmas de genes marcadores para definir tipos de células distintivos, lo que corroboró la validez de nuestro proceso de anotación (archivo de datos de origen).

Si bien se observó cierta heterogeneidad entre pacientes, la composición celular general fue comparable entre órganos (Fig. 2C, Fig. Suplementaria 3A, B). Los neutrófilos se identificaron como el principal grupo de células inmunitarias en todos los pacientes (48,7%; 57.564 células), y el linaje de monocitos/macrófagos como el segundo tipo de células inmunitarias más dominante en general dentro del hígado (7,75%; 18.682 células; Fig. 2C; individuo los pacientes ven el archivo de datos de origen). De manera concordante, la inmunohistoquímica (IHC) mostró neutrófilos (CD15) y monocitos/macrófagos (CD68) como poblaciones de leucocitos residentes dominantes en el tejido hepático (Figura complementaria 4). La proporción de leucocitos identificados por scRNASeq fue validada mediante citometría de flujo en las muestras correspondientes (Fig. 2F).

Los neutrófilos se definieron por un contenido de ARNm excepcionalmente bajo y, por lo tanto, por un número relativamente bajo de transcripciones detectadas por célula (Fig. 2G, H; métricas de control de calidad adicionales se muestran en la Fig. complementaria 3D, E). Recientemente hemos demostrado que, en comparación con otras plataformas scRNASeq, el flujo de trabajo de BD Rhapsody captura una cantidad notablemente alta de moléculas de ARNm por célula y, por lo tanto, puede ser particularmente adecuado para representar células con bajo contenido de ARNm26. Por lo tanto, debido a la cantidad relativamente alta de moléculas de ARNm capturadas por célula, se identificaron neutrófilos con un contenido de ARNm relativamente bajo en nuestro conjunto de datos scRNASeq (Fig. 2H; nCount_RNA medio: 4106; nCount_RNA medio en neutrófilos: 2050), pero no en publicaciones anteriores. conjuntos de datos.

En resumen, el atlas de células inmunes se basa en un total de 21 muestras de biopsia recolectadas de ocho hígados de donantes humanos antes, al final de la NMP y después de la reperfusión. Nuestros análisis desconvolucionan la composición celular y representan neutrófilos no reconocidos previamente con una resolución unicelular.

Para investigar el impacto de la NMP en el panorama de las células inmunitarias del hígado, evaluamos las diferencias en los perfiles de scRNASeq de muestras de biopsias en serie tomadas antes de la NMP (T0) y al final de la NMP (T1) (Fig. 3A; números de células de cada célula). tipo en T0 y T1 se muestran en el archivo de datos de origen).

Un gráfico UMAP de 90.404 células individuales (solo muestras T0 y T1), codificadas por colores según el tipo de célula. B Composición relativa del tipo de células en tejidos hepáticos antes (T0) y al final de (T1) NMP. Gráfico C UMAP de 90.404 celdas individuales, codificadas por colores por punto temporal [antes (T0) y al final de (T1) NMP]. Se resaltan los grupos de monocitos/macrófagos (1) y neutrófilos (2). D Imágenes de inmunofluorescencia múltiple de marcadores inmunológicos presentadas solas y junto con pan-citoqueratina y el mapa de fenotipado pre (T0) y al final de (T1) NMP. El mapa de fenotipado se generó en InForm, cada punto de color representa un fenotipo de la célula, puntos negros: otras células de fenotipo desconocido. Las imágenes se muestran con un aumento de ×20 (barra de escala: 100 µm). E, F Densidades celulares (número de células/mm2) para marcadores inmunológicos individuales en 10 pacientes. El panel superior E presenta los valores para cada hígado individual antes (T0) y al final de (T1) NMP. El panel inferior F presenta un análisis estadístico de columnas para cada biomarcador (n = 10, prueba t pareada, de dos colas, media ± SEM, **p = 0,0097).

Lo más sorprendente es que la proporción de neutrófilos disminuyó con el tiempo de perfusión, mientras que la proporción de monocitos/macrófagos, células T y células B cambió sólo marginalmente durante la NMP (Fig. 3B). El uso de tinción IF múltiple de varias células inmunitarias en biopsias obtenidas de 10 hígados adicionales confirmó estos hallazgos: la NMP no afectó notablemente el número y la distribución de monocitos/macrófagos (CD68), células T (CD3 y CD8) y células B (CD20). , mientras que el número absoluto de neutrófilos (CD15) disminuyó significativamente (p <0,001) con el tiempo (Fig. 3D-F), a pesar de que los neutrófilos permanecieron prominentes durante todo el período de perfusión (Fig. 3B, D-F).

Curiosamente, la NMP indujo un cambio notable en el perfil transcriptómico de neutrófilos y monocitos/macrófagos (Fig. 3C), mientras que el nivel de estrés celular definido por la cantidad relativa de transcripciones mitocondriales detectadas (% MT, Fig. Suplementaria 5A) y la expresión génica Los niveles de un conjunto de importantes transcripciones relacionadas con el estrés y la apoptosis (Figura complementaria 5B) no se vieron notablemente afectados por la NMP. En resumen, la NMP disminuye significativamente los neutrófilos hepáticos en cantidad y proporción a lo largo del tiempo de perfusión, mientras que otros tipos principales de células inmunitarias no se ven notablemente afectados.

Luego evaluamos la firma transcriptómica de los neutrófilos que comprenden la población de células inmunes intrahepáticas más grande y anotamos subpoblaciones para investigar el impacto de la NMP en la expresión genética y los cambios de fenotipo con mayor detalle. La Figura 4A representa genes marcadores conocidos en neutrófilos, incluidos IFITM2, CSF3R, FPR1, FCGR3B, VNN2, G0S2, CXCR2 y SOD2. CXCR2 es de particular interés, ya que se expresa predominantemente en el grupo de neutrófilos (Fig. 4B, C; los datos de pacientes individuales y biopsias se muestran en la Fig. 6A complementaria). Observamos un patrón de expresión comparable para CXCR1 (Fig. 4C, Fig. Suplementaria 6B). Por lo tanto, NMP resultó en una reducción significativa de los niveles de expresión de los genes CXCR2 y CXCR1 (Fig. 4D). Validamos la expresión de la proteína correspondiente del receptor de quimiocina CXC (CXCR) 2 en neutrófilos mediante tinción IF múltiple de 10 hígados antes y al final de NMP (Fig. 4E). De manera similar a la disminución del número de neutrófilos (Fig. 3D-F), la expresión de la proteína CXCR2 en los neutrófilos se redujo significativamente durante la NMP (Fig. 4F). Paralelamente, la expresión del ARNm de CXCR4 se elevó notablemente durante la NMP, lo que indica un aumento potencial en la proporción de neutrófilos agotados/envejecidos (Fig. 4D)27.

A Niveles de expresión genética de genes específicos de neutrófilos en tipos de células individuales. B Niveles de expresión del gen CXCR2 en tipos de células individuales. Cada punto representa la media de un paciente (n = 8). Gráficos C UMAP de 41 177 neutrófilos, codificados por colores según el momento y los niveles de expresión de los genes CXCR2, CXCR1 y CXCR4. D Niveles de expresión de los genes CXCR2, CXCR1 y CXCR4 en neutrófilos antes (T0) y al final de (T1) NMP. Cada punto representa la media de un paciente (n = 7). Las tasas de falsos descubrimientos (FDR) se determinaron mediante análisis pseudomasivo con DESeq2. E Tinción inmunofluorescente de CXCR2 y CD15 pre (T0) NMP. Las imágenes se muestran con un aumento de ×20 (barra de escala: 100 µm, n = 10, para cada muestra se tomaron 4 imágenes representativas). F Densidad celular (número de células/mm2) de células CXCR2+ antes (T0) y al final de (T1) NMP. El gráfico superior presenta los valores para cada hígado individual, el gráfico inferior es un análisis estadístico de columnas (n = 10, prueba t pareada, de dos colas, media ± SEM, *p = 0,02). Nivel de expresión del gen G CXCL8 en neutrófilos antes (T0) y al final de (T1) NMP. Cada punto representa la media de un paciente (n = 7). Las tasas de falsos descubrimientos (FDR) se determinaron mediante análisis pseudomasivo con DESeq2. Gráfico H UMAP de 90.404 células individuales (solo muestras T0 y T1), coloreadas por la expresión del gen CXCL8. Se resaltan los grupos de monocitos/macrófagos (1) y neutrófilos (2). I Señalización diferencial de neutrófilos a otros tipos de células. Panel superior: ligandos de neutrófilos expresados ​​diferencialmente en T0 frente a T1 (prueba de Wald DESeq2 bilateral en pseudo-masa, los valores de p se ajustaron a la tasa de descubrimiento falso (FDR)). Los colores rojos indican una regulación positiva en T1 en comparación con T0. Panel inferior: receptores respectivos y expresión por tipo de célula. Los tamaños y colores de los puntos se refieren a la fracción de células que expresan el receptor y la expresión genética, respectivamente, promediadas en todos los pacientes. Los puntos solo se muestran para los receptores que se expresan en al menos el 10% de los respectivos tipos de células. En todos los diagramas de caja, la línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartil (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR.

El impacto de NMP en la firma genética de los neutrófilos se evaluó adicionalmente mediante el análisis de genes expresados ​​diferencialmente (DEG) (T0 frente a T1; los DEG regulados superiormente y seleccionados se muestran en la figura complementaria 6C). Identificamos una regulación positiva significativa de CXCL8/IL-8 en el grupo de neutrófilos durante la NMP (Fig. 4G; archivo de datos fuente). CXCL8 es un ligando proinflamatorio afín para CXCR2 y CXCR1 y que media la activación de neutrófilos y la formación de trampa extracelular de neutrófilos (NET)28. Los neutrófilos y, en menor medida, los monocitos/macrófagos fueron las principales fuentes para la producción de CXCL8 (Fig. 4H). De manera concordante, el análisis de las redes de comunicación entre células utilizando CellChat29 indicó activación autocrina de neutrófilos (Fig. 4I), así como activación de neutrófilos activada por monocitos/macrófagos (ver más abajo) a través de la señalización CXCL8-CXCR1/CXCR2 durante NMP, respectivamente.

El perfil transcripcional de los neutrófilos al final de NMP se parecía a un fenotipo que identificamos y caracterizamos recientemente como neutrófilos envejecidos/activados crónicamente/agotados en tejidos tumorales de cáncer de pulmón de células no pequeñas (Fig. 5A: expresión reducida de CXCR1, CXCR2, PTGS2, SELL y expresión elevada de CXCR4, CD83, CCRL2, CCL3, CCL4, ICAM1)26. La regulación positiva de VEGFA (Fig. 5A, Fig. 6C complementaria), así como los patrones elevados de comunicación celular de VEGFA-KDR1/FLT1 desde los neutrófilos hacia las células endoteliales (Fig. 4I), sugieren que durante la reparación del tejido con NMP se induce mediante la revascularización de tejido dañado.

A Expresión de genes marcadores seleccionados en neutrófilos antes (T0) y al final de (T1) NMP en pacientes individuales (n = 7). La línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartil (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR. Prueba de Wald DESeq2 bilateral en pseudo-masa, los valores p se ajustan a la tasa de descubrimiento falso (FDR) utilizando ponderación de hipótesis independiente (IHW). B UMAP de neutrófilos coloreados por subgrupos (N0, N1, N2, N3). C Expresión de genes marcadores seleccionados en subgrupos de neutrófilos. D Composición relativa de los subgrupos de neutrófilos antes (T0) y al final de (T1) NMP. E Actividad diferencial del factor de transcripción (TF) por tipo de célula en T0 frente a T1 calculada utilizando DoRothEA. El rojo indica la regulación positiva de un regulón TF en T1 en comparación con T0. Los valores de p se determinaron mediante una prueba t bilateral y se ajustaron según la tasa de falsos descubrimientos (FDR). Las estadísticas t se calcularon utilizando un modelo lineal multivariado implementado en deacoplador-py. F Análisis de sobrerrepresentación de conjuntos de genes (ORA) de conjuntos de genes "Hallmark" seleccionados por tipo de célula en T0 frente a T1. Un valor p pequeño indica que entre los genes del conjunto de genes, se expresan diferencialmente más genes de lo esperado por casualidad (prueba exacta de Fisher de una cola).

A continuación, separamos los neutrófilos mediante agrupación de Leiden no supervisada en cuatro subconjuntos (N0 – N3; Fig. 5B; los genes regulados principales se muestran en el archivo de datos de origen), que fue respaldado por todos los pacientes (Datos complementarios 6D). El grupo N0 se caracterizó por la expresión de genes proinflamatorios que inducen la migración de neutrófilos a sitios de inflamación (S100A12, S100A8, S100A9, MMP8, MMP9)30,31,32, el cofactor de NETosis PADI433, así como genes implicados en Adhesión celular mediada por integrinas (ITGAM, ITGA1, ITGA6). Por lo tanto, el grupo N0 representa un fenotipo de neutrófilos proinflamatorio y altamente activado. El grupo N1 era bastante similar al grupo N0, pero mostró una expresión elevada de ITGA4 así como de TAFA4, que modula las funciones de reparación del tejido de los macrófagos34 (Fig. 5C, archivo de datos fuente). En particular, la proporción de neutrófilos proinflamatorios N0 y N1 disminuyó claramente durante el transcurso de la NMP, mientras que los neutrófilos N2 se enriquecieron notablemente (Fig. 5D). El grupo N2 se parecía al fenotipo envejecido/activado crónicamente/agotado descrito anteriormente (CXCR4, CD83, CCRL2, CCL3, CCL4, ICAM1, VEGFA). Los neutrófilos N2 también expresaron OLR1 (Fig. 5C, archivo de datos fuente), un marcador que identificamos recientemente en neutrófilos asociados a tumores crónicamente activados26. Concordantemente, el análisis de la actividad del factor de transcripción (TF) reveló que la NMP desencadenó una inducción significativa de PPARG (Fig. 5E), un regulador transcripcional directo de OLR135. El grupo N3 mostró una alta expresión de genes mitocondriales (MT-CYB, MT-ND4, MT-ATP6), lo que indica el inicio de la apoptosis celular, así como genes implicados en la respuesta de fase aguda (SAA1, SAA2) y la señalización del interferón (IFIT1, IFIT2)36 (Fig. 5C, archivo de datos fuente). En particular, los neutrófilos N3 disminuyeron durante la NMP (Fig. 5D).

En conjunto, nuestros hallazgos indican que la NMP desplaza a los neutrófilos de un estado proinflamatorio activado hacia un fenotipo envejecido/activado crónicamente/agotado en hígados humanos, lo que sugiere una atenuación de los procesos inflamatorios agudos desencadenados por los neutrófilos durante la NMP.

Para evaluar las asociaciones entre los perfiles de expresión de distintas poblaciones celulares y conjuntos de genes seleccionados indicativos de procesos y vías celulares, se realizaron análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) (Fig. 5F). En los neutrófilos se reconocieron varias vías implicadas en las respuestas inflamatorias, la apoptosis y las actividades supresoras de tumores. Los monocitos/macrófagos señalaron vías implicadas en funciones efectoras del complemento. La activación del complemento está implicada en procesos inflamatorios crónicos, pero también apoya un microambiente inmunosupresor e induce angiogénesis así como reparación de tejidos37. Estos hallazgos sugieren un cambio hacia monocitos/macrófagos con propiedades antiinflamatorias, curativas y regeneradoras de tejidos.

Dado que los monocitos/macrófagos tienen una función reguladora clave en las respuestas inflamatorias hepáticas, evaluamos su fenotipo con mayor detalle. Los monocitos/macrófagos caracterizados por la expresión del marcador de superficie celular CD68 se alteraron significativamente en su perfil transcriptómico durante la NMP (Fig. 3C, 6A, Fig. 7A complementaria; Fig. 6B: genes marcadores conocidos en células de monocitos/macrófagos CST3, CTSB, MS4A7, 1 DE MARZO , CD68, MAFB, CD163, VCAN y CSF1R)38,39. La expresión elevada de CXCL8 en monocitos/macrófagos (Fig. 4H) y la inducción significativa de quimiocinas proinflamatorias CCL2 y CCL3 (DEG superior seleccionado en células de monocitos/macrófagos antes y al final de NMP se muestran en la Fig. 7C complementaria) indican que durante la NMP, el fenotipo de los monocitos/macrófagos cambia hacia un estado proinflamatorio. El análisis de la comunicación entre células indicó una señalización de SPP1 (osteopontina) fuertemente elevada hacia sus receptores afines (por ejemplo, CD44) expresados ​​en una variedad de células inmunes (Fig. 6G). Ostepontin afecta la inflamación aguda y crónica ya que regula la migración, polarización y activación de las células inmunes40. A diferencia de la estimulación proinflamatoria, la NMP disminuyó la expresión de genes clave que caracterizan el estado inflamatorio de los monocitos/macrófagos (LYZ, FCN1, VCAN, HLA-DRA, S100A8, S100A9, S100A12, MNDA, CSTA, CD74) y elevó el nivel de expresión. de marcadores asociados con un fenotipo tolerogénico (CD163, MARCO, HMOX1, VSIG4, NSMAF, CTSB, VMO1; Fig. 6B y Fig. Suplementaria 7C) 17. Tradicionalmente, los macrófagos se clasifican en inflamatorios o inmunorreguladores41. La expresión del gen VSIG4 media la tolerancia de las células T y de las células T asesinas naturales (NKT) durante la lesión hepática mediada por el sistema inmunitario42. De manera similar, la caída de la HMOX1 (hemoxigenasa) en ratones provoca inflamación hepática43. MacParland et al. demostraron que la expresión de MARCO está predominantemente elevada en macrófagos humanos no inflamatorios17.

Gráficos UMAP de 13.720 monocitos/macrófagos, codificados por colores por punto temporal [pre (T0) y al final de (T1) NMP], y del nivel relativo de expresión del gen CD68. B Niveles de expresión génica de marcadores inflamatorios (LYZ, FCN1, VCAN, HLA-DRA) y marcadores tolerogénicos (CD163, MARCO, HMOX1 y VSIG4) en monocitos/macrófagos pre (T0) y al final de NMP (T1). Cada punto representa la media de un paciente (n = 7). Las tasas de falsos descubrimientos (FDR) se determinaron mediante análisis pseudomasivo con DESeq2. La línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartil (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR. C Niveles de expresión genética de genes específicos de monocitos/macrófagos. D UMAP de monocitos/macrófagos coloreados por subgrupos (M0, M1, M2, M3). E Expresión de genes marcadores seleccionados en subgrupos de monocitos/macrófagos. F Composición relativa de subgrupos de monocitos/macrófagos antes (T0) y al final de (T1) NMP. G Señalización diferencial de monocitos/macrófagos a otros tipos de células. Panel superior: ligandos expresados ​​diferencialmente de monocitos/macrófagos en T0 frente a T1 (prueba de Wald DESeq2 bilateral en pseudo-masa, los valores de p se ajustaron a la tasa de descubrimiento falso (FDR)). Los colores rojos indican una regulación positiva en T1 en comparación con T0. Panel inferior: receptores respectivos y expresión por tipo de célula. Los tamaños y colores de los puntos se refieren a la fracción de células que expresan el receptor y la expresión genética, respectivamente, promediadas en todos los pacientes. Los puntos solo se muestran para los receptores que se expresan en al menos el 10% de los respectivos tipos de células. Sólo se muestran los ligandos regulados positivamente. La lista de interacciones reguladas a la baja está disponible en el archivo de datos de origen.

Para analizar aún más la plasticidad de los monocitos/macrófagos durante la NMP, realizamos agrupaciones de Leiden sin supervisión e identificamos cuatro subconjuntos distintivos (M0 a M3) (Fig. 6D, Fig. 6E; los genes marcadores regulados superiormente se muestran en el archivo de datos de origen) en todos los hígados. (Figura complementaria 7D). El subgrupo M0 mostró una alta expresión de varios genes proinflamatorios, lo que sugiere que este grupo representa monocitos/macrófagos inflamatorios (LYZ, VCAN, S100A8, S100A9, S100A12, MNDA). De acuerdo con el análisis DEG, la proporción de monocitos/macrófagos M0 proinflamatorios se redujo fuertemente durante la NMP (Fig. 6F). El subgrupo M1 fue sorprendentemente similar a una población de macrófagos C1Q+ reportada con frecuencia (C1QB, MRC1, HLA-DOA, FOLR2)44. La regulación positiva observada de genes relacionados con la vía del complemento (C1QB, C1QC, AXL) sugiere un papel potencial del subgrupo M1 en la eliminación del tejido lesionado mediante eferocitosis45,46. Por el contrario, el grupo M2 mostró un perfil de expresión génica comparable al de los monocitos no clásicos (CDKN1C, CYFIP2)47,48, así como una alta expresión de CX3CR1, un marcador que define a los monocitos que se dirigen constitutivamente a los tejidos y contribuyen a la reparación y reparación de tejidos. curación de heridas49. Si bien los subgrupos M1 y M2 no cambiaron notablemente durante la NMP, el grupo M3 aumentó significativamente (Fig. 6F). Este subgrupo se caracterizó por la expresión de marcadores predominantemente asociados con macrófagos activados alternativamente ("tipo M2"). Los macrófagos tipo M2 inducen la proliferación celular y la angiogénesis, pero también participan en la eliminación de desechos celulares y el fomento de la reparación de tejidos (PLAU, CXCL5, CFS1, FPR3, SPP1, CTSL, IL4I1, HS3ST1, SERPINB2, SLC7A11)50,51,52,53. 54,55,56,57,58,59,60,61. El subgrupo M3 también expresó FN1 (fibronectina), que participa en la formación de la matriz extracelular y los mecanismos de reparación de heridas62. Es de destacar que el análisis de la comunicación entre células en monocitos/macrófagos indicó una señalización elevada de FN1, por ejemplo, hacia su receptor afín ITGB1 expresado en colangiocitos (Fig. 6G). Además, se identificaron numerosos marcadores antiinflamatorios en el grupo M3: los marcadores PHLDA1, MMP19, FABP5, NRP1, NRP2, RASGRP3, DHRS9, MT1H indican una atenuación potencial de la producción de citocinas proinflamatorias63,64,65,66,67 ,68,69,70,71.

En resumen, nuestros datos mostraron que la inducción de productores proinflamatorios y un fenotipo proinflamatorio general de monocitos/macrófagos se acompaña de la inducción de subtipos de células antiinflamatorias y tolerogénicas (“similares a M2”) que contribuyen a la proliferación celular. angiogénesis, cicatrización de heridas y reparación de tejidos.

Después de definir el panorama unicelular de las células inmunes residentes en los tejidos durante la NMP, a continuación nos centramos en el compartimento de perfusión. Por lo tanto, investigamos la dinámica de las células inmunitarias en la perfusión de 26 hígados adicionales y vinculamos estas observaciones con las alteraciones de las células inmunitarias intrahepáticas durante la NMP (Fig. 7A). La viabilidad celular se confirmó en una serie de muestras de perfusión (Fig. 7B). Tan pronto como 1 h después del inicio de NMP, se observó un rápido aumento del número absoluto de leucocitos CD45+ (2537/μl [2003, 3215]). Los subconjuntos dominantes fueron granulocitos CD45+HLA-DRlow (1947/μl [1510, 2511]), células T CD45+CD3+ (203/μl [157, 263]), células NK CD45+CD56+ (99/μl [68, 143] ]), células B CD45+CD19+ (52/μl [38, 71]) y monocitos/macrófagos CD45+CD14+ (37/μl [26, 54]) (Fig. 7C, D). El análisis de regresión indicó un cambio estadísticamente significativo en el número absoluto de células durante el tiempo de perfusión para todos los subtipos de leucocitos. Mientras que las células B CD45+CD19+ y los monocitos/macrófagos CD45+CD14+ alcanzaron su punto máximo a las 6 h, se observó una disminución en el número total de leucocitos para todos los subconjuntos más allá de las 6 h de NMP (Fig. 7E, F, Tabla complementaria 2).

Un flujo de trabajo de análisis de perfusión de NMP y métodos aplicados. Las pruebas de viabilidad de las células B antes de la citometría de flujo (n = 3 antes, a 1 h de NMP y al final de NMP) mostraron solo un porcentaje muy pequeño de células no viables en el perfundido. C Cantidades absolutas de leucocitos CD45+ para los principales subtipos de células inmunitarias en el perfundido circulante total (media ± SEM) y composición D a 1 h NMP. E, F Cambio dinámico de leucocitos CD45+ totales y subtipos principales durante la NMP. G Cambio dinámico de los subtipos de células T CD3+ (proporciones) durante el tiempo de perfusión. Los gráficos muestran los efectos marginales. Los valores se estiman mediante análisis de regresión lineal. Los valores p se refieren al cambio a lo largo del tiempo. Las medias de mínimos cuadrados calculadas utilizando un modelo lineal se muestran junto con el IC del 95%. N = 26 muestras biológicamente independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Células NK, células asesinas naturales, células NKT, células T asesinas naturales, células MAIT, células T invariantes asociadas a mucosas.

La proporción de neutrófilos identificada en el atlas de células inmunitarias scRNASeq y la tinción IF en el tejido hepático disminuyó con el tiempo de NMP, mientras que se encontró un número absoluto alto de neutrófilos en el perfundido. Estos hallazgos correspondientes indican una rápida migración de neutrófilos al perfundido. Esto también es válido, aunque en menor medida, para otras células inflamatorias. Estos cambios celulares se corresponden con los patrones de células inmunitarias obtenidas en biopsias de hígado con respecto a sus patrones y dinámicas cuantitativos básicos. En resumen, se encontró una migración rápida y significativa principalmente de neutrófilos al perfundido.

Además, caracterizamos los subtipos de las principales poblaciones de células inmunitarias y sus cambios dinámicos en cinco muestras de perfusión en serie mediante citometría de flujo. A 1 h de NMP, los subconjuntos de células T CD45+CD3+ en el perfusado comprendían el 48% [42, 54] de células T auxiliares CD3+CD4+, mientras que el 44% [37, 50] eran células T citotóxicas CD3+CD8+. La proporción de ambos subconjuntos cambió significativamente a favor de las células T auxiliares CD4+ durante el tiempo de perfusión. Las células CD3+CD56+ NKT y las células T invariantes asociadas a la mucosa (MAIT) del receptor de células T CD3+ (TCR) Vα2.2+CD161+ representaron solo pequeñas proporciones de células T totales sin una dinámica relevante durante el tiempo de perfusión (Fig. 7G). Las proporciones de células T de memoria CD3+CD4+ cambiaron significativamente durante el tiempo de perfusión (Fig. 8A), mientras que las células T de memoria CD3+CD8+ permanecieron estables (Fig. 8B). CD4+CD25+FoxP3+ Tregs comprendieron el 2,32% [1,58, 3,28] de la población de células T a 1 h. En particular, su proporción aumentó significativamente durante el tiempo de perfusión hasta el 4,71 % [3,29, 6,59] a las 24 h de NMP (Fig. 8C). Las células NK CD45+CD56+ eran en su mayoría CD56dimCD16+ (94,21 % [96,11, 91,58] sin cambios significativos a lo largo del tiempo (Fig. 8D). Entre los monocitos/macrófagos CD14+CD16+, las células de Kupffer CD14+CD64+CD163+ comprendían sólo pequeñas proporciones en el perfundido. a 1 h (5,56 % [3,39, 8,78]), pero se observó un fuerte aumento proporcional con la perfusión prolongada (24 h NMP: 11,86 % [7,05, 19,52], Fig. 8E). Entre los subtipos numéricamente prominentes (es decir, CD45+HLA -DRlow granulocitos), los neutrófilos CD15+CD16+ dominaban (93,45%% [88,90, 96,30]) sobre muy pocos eosinófilos Siglec-CD8+CD16- (0,38% [0,20, 0,59]) y basófilos CD16+CD123+ (0,23% [ 0,13, 0,34]) a 1 h NMP. Sus proporciones se mantuvieron sin cambios con el tiempo (Fig. 8F). Las células dendríticas representaron solo una pequeña proporción del total de leucocitos (0,86% [0,53, 1,27] a 1 h NMP) sin una dinámica significativa durante NMP (Fig. 8G, Tabla complementaria 3).

Se evaluaron los perfundidos recolectados en varios momentos durante la NMP (n = 26 hígados sometidos a NMP) para determinar sus cambios dinámicos en las proporciones de células T CD4+ A, células T CD8+ B, subtipos C de células T CD3+ con propiedades reguladoras, D CD56+ NK. células, monocitos/macrófagos E CD45+CD14+, granulocitos F CD45+HLA-DRlow y células dendríticas G. Los gráficos muestran los efectos marginales. Los valores se estiman mediante análisis de regresión lineal. Los valores p se refieren al cambio a lo largo del tiempo. Las medias de mínimos cuadrados calculadas mediante un modelo lineal se muestran junto con el IC del 95 %. N = 26 muestras biológicamente independientes. H Niveles de expresión genética de factores proinflamatorios indicados (interleucinas/quimiocinas) en monocitos/macrófagos y neutrófilos antes (T0) y al final de NMP (T1) según lo evaluado por scRNASeq en ocho hígados de donantes. I Espectro de interleucinas/quimiocinas proinflamatorias evaluadas producidas por monocitos/macrófagos y neutrófilos y elevadas en el nivel de proteína en muestras de perfusión recolectadas durante el tiempo de perfusión de 26 hígados de donantes. (J) Niveles de expresión genética de IL-6 y TNF en monocitos/macrófagos y neutrófilos antes (T0) y al final de NMP (T1) según lo evaluado por scRNASeq en hígados trasplantados (n = 6) y desechados (n = 2) . La línea central denota la mediana. Los cuadros representan el rango intercuartil (IQR) de los datos, los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos dentro de 1,5 veces el IQR. Además, se midieron los niveles de IL-6 y TNF en el perfundido de 26 hígados de donantes sometidos a NMP a las 1, 4, 6, 12 y 24 h de NMP y las diferencias entre trasplantados (n = 18) y descartados (n = 8). Se calcularon los hígados. Los gráficos muestran los efectos marginales. Los valores se estiman mediante análisis de regresión lineal. Los valores p se refieren al cambio a lo largo del tiempo. Las medias de mínimos cuadrados calculadas mediante un modelo lineal se muestran junto con el IC del 95 %. N = 26 muestras biológicamente independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Tcm: células T de memoria central, Tem: células T efectoras de memoria, Temra: células efectoras de memoria que reexpresan células T CD45RA, células T DN: células T doble negativas (CD4− y CD8-), células NK Células asesinas naturales, DC células dendríticas.

Estos datos resaltan la movilización de un amplio espectro de leucocitos en el perfundido circulante durante la NMP. El análisis de muestras seriadas tomadas durante el transcurso del período de 24 h de NMP reveló una dinámica de migración distinta. Si bien la migración de varios subtipos de células inmunitarias al perfundido apareció muy rápidamente, la movilización y liberación de células Tregs y Kupffer aumentaron tan pronto como 12 h después de la NMP.

A continuación, investigamos los niveles de expresión de genes de interleucina/quimiocina en células inmunitarias y los niveles de proteína en muestras de perfusión en serie. Mientras que los monocitos/macrófagos expresaron cada vez más IL1B, IL18, CXCL8, CCL2, CCL3, CCL4 y TNF proinflamatorios, los neutrófilos expresaron principalmente CXCL8 y, en menor medida, IL1B y CXCL1 (Fig. 8H). La expresión de marcadores antiinflamatorios como la IL10 se indujo en monocitos/macrófagos (Fig. 8H)72.

De acuerdo con el conjunto de datos transcriptómicos, las citocinas proinflamatorias expresadas en monocitos/macrófagos y neutrófilos también aumentaron en el perfundido con el tiempo, lo que denota un aumento de la transcripción y la liberación de proteínas en el microambiente hepático y el perfundido (Fig. 8I). La Figura 8 complementaria muestra la dinámica de todas las citocinas/quimiocinas en el nivel de proteína durante el tiempo de perfusión (los valores respectivos se dan en la Tabla 4 complementaria). Solo se encontraron alteraciones leves en las firmas transcriptómicas de las células T y NK (Figura complementaria 9).

Se evaluó con más detalle el impacto del tipo de donante (donación después de muerte cerebral (DBD) versus DCD) y la idoneidad para el trasplante (hígados trasplantados versus desechados) en la dinámica de las citocinas proteicas. La mayoría de las citocinas de la perfusión aumentaron con el tiempo de perfusión prolongado en todos los grupos. Las concentraciones de IL-6 se elevaron de manera más significativa en la perfusión de injertos de DCD en comparación con los injertos de DBD (p = 0,05, figura complementaria 10, tabla complementaria 5). Este fenómeno también se observó al comparar hígados desechados con hígados trasplantados (p = 0,032, Fig. 8J, Fig. 10 complementaria, Tabla 6 complementaria). Concordantemente, encontramos una expresión elevada de IL6 en monocitos/macrófagos a nivel transcripcional, lo que indica que este tipo de célula contribuye al menos sustancialmente a la producción de IL-6 (Fig. 8J). Además de la IL-6, también el factor de necrosis tumoral (TNF) aumentó significativamente en el perfundido cuando se compararon los hígados desechados con los trasplantados (p = 0,012, Fig. 8J, Fig. 11 complementaria, Tabla complementaria 6).

En conjunto, nuestros datos sugieren que la respuesta inmunológica durante la NMP hepática varía entre los tipos de donantes y los injertos de "baja calidad" (no aptos para trasplante) frente a los "aceptables".

La NMP ex vivo de órganos humanos es una herramienta clínica que avanza rápidamente para mejorar y prolongar la conservación de órganos. Además, la capacidad de evaluar la función antes del trasplante aborda una necesidad no cubierta y ofrece una posibilidad única de dilucidar los eventos moleculares durante la reperfusión. Esta tecnología también puede sentar las bases para futuros tratamientos específicos de órganos ex vivo. Como el hígado contiene una gran cantidad de células inmunitarias con importantes funciones inmunorreguladoras y de importancia central para una función hepática adecuada73, caracterizamos en profundidad (sub)poblaciones de células inmunitarias en hígados de donantes humanos y perfundimos durante la NMP y evaluamos las citocinas de la perfusión. El mapeo profundo de las células inmunes indicó un predominio de neutrófilos en los hígados del donante, que se movilizan rápidamente en la perfusión durante la NMP. Los neutrófilos transitan de un estado proinflamatorio activado hacia un fenotipo envejecido/crónicamente activado/agotado y los monocitos/macrófagos expresan características antiinflamatorias/tolerogénicas esenciales para la reparación de tejidos.

La NMP en 34 hígados de donantes humanos incluidos en este estudio transcurrió sin incidentes y permitió repetir la evaluación de muestras de tejido y perfusión sin impacto en la integridad del órgano. Se identificaron los neutrófilos como la transcriptómica sc basada en la población de células inmunitarias más prevalente realizada en ocho hígados de donantes. Los análisis Multiplex IF e IHC corroboraron que los neutrófilos CD15+ son el tipo de célula inmunitaria hepática dominante, distribuidos por todo el órgano en un patrón manchado. Curiosamente, hasta donde sabemos, el linaje de neutrófilos se descarta por completo en los conjuntos de datos de scRNASeq de hígados humanos publicados hasta ahora17,18,19,22,23,24,74. Es muy probable que esta discrepancia se atribuya a errores metodológicos más que a un fenómeno biológico. Debido a que los neutrófilos son un tipo de célula notablemente efímera75 y extremadamente frágil que es particularmente sensible a la disociación y clasificación de tejidos, un flujo de trabajo rápido pero suave desde la disociación de tejidos hasta la lisis celular es esencial para preservar estas células. Además, los neutrófilos expresan una cantidad excepcionalmente baja de moléculas de ARNm76, lo que impide su recuperación en los datos de scRNASeq. Recientemente demostramos que los neutrófilos no se pueden detectar adecuadamente en conjuntos de datos generados con la plataforma de secuenciación de cromo 10x basada en gotas y solo de forma muy limitada con otras plataformas. Sin embargo, la plataforma scRNASeq basada en micropocillos aplicada en este estudio permite capturar un número relativamente alto de moléculas de ARNm por célula y, por lo tanto, mejora la recuperación de células con bajo contenido de ARNm26. Si bien scRNASeq de ocho hígados generó un enorme conjunto de datos, el número total y el espectro de diferencias en la calidad del hígado siguen siendo una limitación. Aunque incluimos hígados ECD en este estudio, los órganos pueden variar en cuanto a la calidad del injerto y las enfermedades/daños preexistentes, lo que hace imposible capturar toda la amplitud de la variación interindividual en este esfuerzo.

Se ha demostrado que los circuitos inflamatorios impulsados ​​por neutrófilos, como se observa en nuestras perfusiones de NMP, promueven diversas patologías hepáticas agudas y crónicas77. Al igual que los neutrófilos, los monocitos/macrófagos son reguladores clave de la homeostasis tisular y la activación inmune dentro del hígado78. Aquí proporcionamos evidencia de que la NMP desencadena un cambio de neutrófilos altamente activados hacia un fenotipo envejecido/crónicamente activado/agotado en hígados humanos. Específicamente, la activación de los neutrófilos por la NMP se refleja en la inducción del eje IL-8/CXCR1/2, que contribuye al micromedio proinflamatorio. Esto también puede conducir a la formación inducida de NET, lo que resulta en un agravamiento de la IRI hepática79. Estos hallazgos sugieren que la inhibición de CXCR1/2 durante la activación de los neutrófilos puede ayudar a limitar una respuesta inflamatoria excesiva durante la NMP.

La dinámica de los monocitos/macrófagos durante la NMP no puede describirse sin ambigüedades como un fenotipo pro o antiinflamatorio, sino que indica una secuencia de respuesta y contrarespuesta. Esto también se refleja en el análisis de subgrupos que demuestra que los monocitos/macrófagos proinflamatorios disminuyen, mientras que los subtipos antiinflamatorios y tolerogénicos (“similares a M2”) implicados en la proliferación celular, la angiogénesis, la cicatrización de heridas y la reparación de tejidos aumentan significativamente durante la NMP. respectivamente.

La comprensión actual del impacto de la NMP (y de la perfusión mecánica en general) en el perfil inflamatorio/repertorio de células inmunes de un órgano es limitada80. En hígados de ratas, se demostró que los patrones moleculares asociados a daños (DAMP) inducen lesiones tisulares durante la perfusión mecánica81. En un modelo similar, se demostró que la NMP induce una amplia firma de expresión genética inflamatoria y la activación de células inmunes residentes en el hígado. El tratamiento con IL-10 y factor de crecimiento transformante (TGF)-ß dio como resultado una moderación de la inflamación en este modelo82. En un estudio realizado en hígados humanos, la NMP inhibió la inflamación y promovió la regeneración del injerto83.

De acuerdo con la expresión mejorada de citocinas observada en seis hígados durante 6 h NMP por Lee et al., encontramos expresión de citocinas tanto pro como antiinflamatorias en el perfundido83. La acumulación de interleucinas/quimiocinas en el perfundido coincide con los cambios transcriptómicos en los neutrófilos y monocitos/macrófagos en el parénquima hepático. Un aumento significativo de IL-6 en la perfusión de injertos de DCD e hígados desechados puede ser indicativo de una respuesta inflamatoria más pronunciada en estos órganos. De hecho, Ohman et al.84 informaron recientemente que la respuesta inmune en hígados de baja calidad o funcionamiento inferior difería de la de los injertos funcionales cuando se sometían a NMP, aunque se informaron niveles exorbitantes de perfusión de IL-6 en ambos grupos. Por lo tanto, nuestras observaciones requieren mayor atención antes de determinar su importancia clínica.

La movilización y transición de leucocitos y, en particular, de neutrófilos al perfundido fue extremadamente rápida. Esto es consistente con datos de pulmones y riñones porcinos durante NMP. En estos estudios, la migración excesiva también se relacionó con una inmunogenicidad reducida con tasas de rechazo agudo más bajas13,14. En este documento describimos las células inmunes perfundidas con gran detalle y brindamos información sobre los cambios dinámicos durante hasta 24 h de perfusión en una cohorte de 26 hígados humanos. Si bien en nuestro estudio estaba presente una cantidad significativa de células en la perfusión al final de la NMP, la disminución de la mayoría de los tipos de células con el tiempo de perfusión parece indicar una mitigación de este efecto. Alternativamente, las células inmunes circulantes pueden regresar al hígado. Estudios de seguimiento futuros y más detallados de las células inmunitarias entre el tejido y el perfundido iluminarán este proceso dinámico con más detalle.

Además, la modulación de este proceso, por ejemplo mediante movilización activa de leucocitos y/o eliminación de leucocitos, puede reducir la carga antigénica/inflamatoria del hígado durante la NMP. Sin embargo, la retirada indiscriminada puede no ser ideal, ya que subconjuntos de células inmunes circulantes también participan en la regeneración y remodelación de tejidos, la curación y la inducción de tolerancia80. Como ejemplo, demostramos una fuerte inducción de un fenotipo antiinflamatorio "similar a M2" en monocitos/macrófagos durante la NMP. Esto puede fomentar los mecanismos de reparación y remodelación de tejidos y, por lo tanto, sugerimos una eliminación más específica de subconjuntos de células inmunes inflamatorias y potencialmente dañinas para los tejidos. Aquí, sugerimos que la focalización selectiva de los neutrófilos proinflamatorios (por ejemplo, mediante antagonistas de CXCR2) podría ser un primer paso hacia la inmunomodulación dirigida durante la perfusión ex vivo. Además, la filtración de citoquinas proinflamatorias durante la NMP también podría ser beneficiosa. Los primeros resultados de un ensayo de perfusión de riñón humano indicaron un efecto positivo sobre las firmas de expresión genética asociadas a la función retardada del injerto85.

En conclusión, nuestro análisis exhaustivo destaca la dinámica del repertorio de células inmunes hepáticas durante la NMP de hígados humanos a nivel transcriptómico y proteico. El mapeo en profundidad de las células inmunes reveló el predominio de neutrófilos en hígados de donantes humanos. Junto con una variedad de otras poblaciones de células inmunes, estas células transmigran rápidamente en gran medida al perfundido durante la NMP hepática. Con la prolongación de la perfusión, el estado de activación de las células inmunitarias diverge de un fenotipo proinflamatorio a uno agotado pero también regenerativo. Nuestros hallazgos y los conjuntos de datos correspondientes pueden servir como base para futuros estudios de intervención y abrir más vías para mitigar la inflamación mediante inmunomodulación dirigida durante NMP y LT.

Esta investigación cumple con todas las normas éticas pertinentes. El estudio fue aprobado por el comité de revisión institucional (protocolo n.º 1175/2018) de la Universidad de Medicina de Innsbruck. Previamente se obtuvo el consentimiento informado de todos los participantes.

Entre abril de 2019 y julio de 2021 se inscribieron un total de 34 hígados de donantes sometidos a NMP. Todos los órganos fueron aceptados con intención de trasplante después de NMP. Los hígados se lavaron durante la recuperación utilizando la solución de la Universidad de Wisconsin (UW, n = 14) o histidina-triptófano-cetoglutarato (HTK, n = 20) y se enviaron según las condiciones estándar de almacenamiento en frío utilizando el mismo líquido de conservación en hielo. Después del transporte a nuestra institución (concepto de regreso a la base), los hígados se perfundieron utilizando el dispositivo OrganOx metra de acuerdo con los protocolos locales2. Al llegar a nuestro centro, los injertos se lavaron con 2000 ml de HTK para eliminar las células sanguíneas restantes. Luego se prepararon quirúrgicamente los hígados para NMP y se conectaron a la máquina de perfusión. El perfundido de NMP constaba de tres unidades de concentrados de glóbulos rojos (RBC, 300 ml cada uno) empobrecidos en leucocitos tipo O (irradiación de 30 Gy), 500 ml de Gelofusine (B. Braun) y aditivos según el protocolo del fabricante. Según los estándares locales, una unidad empaquetada de bolsa de glóbulos rojos empobrecida en leucocitos contiene un máximo de 1 × 106 leucocitos. Se aplicó un protocolo estandarizado para NMP que incluye un esquema para análisis de perfusión como el establecido recientemente en nuestra institución2. Esto incluye un enfoque multidisciplinario con observación y manejo de órganos en la UCI. La decisión de trasplantar o descartar un órgano se basó en la disminución del lactato, el mantenimiento del pH y el consumo de glucosa. El mantenimiento de los valores de pH fisiológico (7,3–7,45) sin suplementación de bicarbonato de sodio después de 2 h de NMP, así como una rápida disminución y mantenimiento del lactato a niveles fisiológicos (≤18 mg/dl), se consideran factores clave que indican una buena función de los órganos. Además, los niveles excepcionalmente altos de AST, ALT y lactato deshidrogenasa (>10.000 U/l) y una fuerte inclinación de estos parámetros se consideran señales de advertencia. Los receptores de hígado incluidos en el estudio eran adultos ≥18 años de edad, en lista para un primer trasplante o un retrasplante.

De 34 hígados de donantes sometidos a NMP, se realizó un análisis scRNASeq en ocho hígados de estudio seleccionados al azar. Por lo tanto, se recogieron muestras de biopsia de hígado en cuña en tres momentos individuales, es decir, antes de NMP (T0), al final de NMP (T1) y después de la reperfusión (T2) si se trasplantaba. Se recogieron muestras de perfusión en serie de otros 26 hígados de estudio a las 1, 4, 6, 12 h y al final de la NMP para la cuantificación/fenotipado celular y la evaluación de citocinas mediante citometría de flujo y análisis Luminex. En la Fig. 1 se proporciona información detallada sobre el número de muestras, la recolección de tejido/perfundido, los momentos temporales y el tipo de análisis.

Las biopsias de hígado tomadas antes (T0) y al final (T1) de NMP, así como después de la reperfusión (T2) (n = 8 hígados), se trituraron inmediatamente en trozos pequeños (<1 mm) en hielo y posteriormente se digirieron enzimáticamente durante 10 minutos. a 37 ° C con agitación utilizando el reactivo de disociación BD TuDoR (BD Biosciences). La suspensión unicelular se filtró a través de un colador celular de 100 µM y los glóbulos rojos se eliminaron con la solución lisante BD Pharm Lyse (BD Biosciences) según el protocolo del fabricante. La viabilidad celular se midió con la plataforma BD Rhapsody scRNASeq (BD Biosciences) utilizando Calcein-AM (Thermo Fisher Scientific) y Draq7 (BD Biosciences).

La suspensión unicelular recién aislada se procesó inmediatamente (<30 minutos desde la disociación del tejido hasta la lisis celular) y se generaron bibliotecas de secuenciación de amplificación del transcriptoma completo (WTA) de acuerdo con el protocolo WTA unicelular de BD Rhapsody. Seleccionamos la plataforma BD Rhapsody scRNASeq basada en micropocillos con la intención de desconvolucionar completamente la dinámica de los leucocitos, ya que permite representar células con bajo contenido de ARNm (por ejemplo, neutrófilos) y puede provocar la pérdida de células grandes >40 µm (hepatocitos). debido a un fenómeno de exclusión de cuentas. La calidad de las bibliotecas de secuenciación obtenidas se verificó con el sistema 4200 TapeStation (Agilent) y el kit de ensayo Qubit dsDNA HS (alta sensibilidad) (Thermo Fisher Scientific). La secuenciación se realizó en la plataforma del sistema NovaSeq 6000 (Illumina) con el kit de reactivos S1 v1.5 (200 ciclos, lectura de índice de 68 pb 1; Illumina) a una profundidad de secuenciación calculada de 50 000 lecturas/célula.

El preprocesamiento bioinformático de los archivos de secuenciación FastQ obtenidos se realizó a través del entorno Seven Bridges Platform (Seven Bridges Genomics) basado en la nube utilizando la aplicación BD Rhapsody WTA Analysis Pipeline. Los datos se cargaron en AnnData86 para su posterior procesamiento con herramientas scverse. El control de calidad se realizó utilizando scanpy87, reteniendo solo células con (1) entre 250 y 8000 genes detectados, (2) entre 1000 y 100 000 transcripciones y (3) <30% de transcripciones mitocondriales. Los 4000 genes más variables (HVG) se seleccionaron utilizando la funciónhigh_variable_genes de scanpy con las opciones sabor = "seurat_v3" y lote_key = "paciente". Los transcriptomas celulares se incluyeron en un espacio latente de baja dimensión corregido por lotes utilizando scVI88,89, tratando cada muestra como un lote separado. Los dobletes se identificaron y eliminaron utilizando SOLO90 tal como se implementó en scvi-tools89. Se calcularon un gráfico de vecindad y una aproximación y proyección de variedad uniforme (UMAP)91 basándose en el espacio latente scVI. Los tipos de células se anotaron basándose en agrupaciones no supervisadas con el algoritmo de Leiden92 y genes marcadores conocidos.

Utilizamos DESeq293 en muestras pseudomasivas para pruebas de expresión diferencial que se ha demostrado que funciona bien y corrige adecuadamente los descubrimientos falsos94. Para cada tipo de célula y paciente, resumimos los recuentos de transcripciones de cada gen que se expresa en al menos el 5 % de las células utilizando desacoplador-py95. Se descartaron muestras pseudomasivas que constan de menos de 1000 recuentos o 10 células. Los valores de p se ajustaron para pruebas de hipótesis múltiples con ponderación de hipótesis independiente (IHW)96. Los genes marcadores para subgrupos de monocitos/macrófagos y neutrófilos se determinaron utilizando el área bajo la curva de características del operador del receptor (AUROC) y métricas de cambio de log2 en muestras pseudomasivas como se define en Becht et al.91. Los genes marcadores se definieron por tener un AUROC > 0,7 y un cambio log2 veces > 1 para neutrófilos y > 2 para monocitos/macrófagos.

Realizamos un análisis de factores de transcripción con DoROthEA97 utilizando un modelo lineal multivariado implementado en deacoplador-py95. Sólo se utilizaron regulones con los niveles de confianza más altos "A" y "B". Se utilizaron como entrada los cambios en veces del análisis DESeq2. Además, realizamos un análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes utilizando una prueba de sobrerrepresentación (ORA, es decir, prueba exacta de Fisher) implementada en deacoplador-py. Las comparaciones DE entre diferentes tipos de células tienen un poder estadístico diferente debido a un número diferente de muestras pseudomasivas. Para evitar sesgos debido a diferentes números de genes expresados ​​diferencialmente por tipo de célula, utilizamos los 182 expresados ​​más diferencialmente para cada tipo de célula para la prueba de sobrerrepresentación, que corresponde al número medio de genes DE en todos los tipos de células en un tasa de descubrimiento falso (FDR) <0,01 y |cambio de log2 veces | > 1.

Utilizamos la base de datos CellChat29 obtenida de omnipathdb29 para investigar las diferencias en la comunicación entre células entre puntos temporales. El algoritmo CellChatDB original está diseñado para encontrar diferencias entre tipos de células. Para nuestro estudio, por otro lado, estábamos interesados ​​en las diferencias entre puntos temporales, utilizando a los pacientes como réplicas biológicas. Por lo tanto, para cada tipo de célula de interés, consideramos la lista de ligandos expresados ​​de manera significativamente diferencial en CellChatDB. Para cada una de esas moléculas de señalización expresadas diferencialmente y para cada tipo de célula, determinamos socios de interacción que se ven potencialmente afectados por ese cambio, como aquellos que se expresan en al menos el 10% de las células de un determinado tipo de célula. Las moléculas de señalización expresadas diferencialmente se determinaron con DESeq2 como se describió anteriormente. La fracción de células que expresan una molécula de señalización se calculó como la media de fracciones por paciente, para evitar sesgos debido a diferentes recuentos de células por paciente.

Las biopsias de hígado tomadas antes (T0) y al final (T1) de NMP (n = 10 seleccionadas al azar de 26 hígados) se fijaron en paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina. La tinción IF multiplexada se realizó en secciones de 4 µm utilizando el kit de inmunohistoquímica automatizada Opal 7-Color (cat: NEL821001KT, Akoya Biosciences). Se configuró un panel de marcadores inmunes que incluye anticuerpos contra CD15, CD8, CD68, CD3, CD20, citoqueratina (Panel 1) y CD15, CXCR2 (Panel 2). Los marcadores se aplicaron secuencialmente y se emparejaron con los respectivos fluoróforos de ópalo (los anticuerpos utilizados se enumeran en la Tabla complementaria 7). La tinción se realizó utilizando un sistema automatizado (BOND-RX; Leica Biosystems). Para visualizar los núcleos celulares, el tejido se tiñó con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI espectral, Akoya Biosciences). Los portaobjetos se escanearon utilizando la estación de trabajo de patología cuantitativa Mantra 2 (Akoya Biosciences) y el software Mantra Snap v1.0.4. Para el análisis se adquirieron de cinco a ocho imágenes representativas de cada tejido. La desmezcla espectral, el análisis de imágenes multiespectrales y el fenotipado celular se llevaron a cabo utilizando el software de análisis de tejidos inForm v2.4.10 (Akoya Biosciences). La densidad de células inmunes se cuantificó y se expresa como "número de células/mm2". Se utilizó la prueba t pareada para evaluar las diferencias entre los dos grupos. En el análisis agrupado, los puntos de datos se presentan en diagramas de dispersión con medias ± error estándar de la media (SEM). Los análisis se realizaron con GraphPad Prism v6.0.

Las células aisladas de biopsias de hígado antes de NMP (T0) y al final de NMP (T1) se tiñeron con un cóctel de 19 anticuerpos (Tabla complementaria 8) en concentraciones pretituladas y, después de lavar y agregar 7-AAD, se midieron. en un citómetro de flujo FACSymphony A5. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo v10.7 (para obtener detalles sobre la estrategia de activación, consulte la Figura complementaria 12).

Se recogieron muestras de perfusión en serie de 26 hígados sometidos a NMP (5 ml) en tubos Cyto-Check BCT (Streck) a las 1, 4, 6, 12 hy al final de NMP. La fijación celular inmediata en estos tubos mantiene la morfología celular y la expresión del antígeno de superficie y permite el almacenamiento de muestras a temperatura ambiente al menos durante 5 días. En nuestro estudio se eligieron tubos de fijación para facilitar la logística. Se utilizaron 500 µl de perfundido para cada tinción. Inicialmente, se lisaron glóbulos rojos de 500 µl de perfundido con el tampón de lisis RBC (Thermo Scientific, eBioscience). Después de bloquear con reactivos de bloqueo de Fc (BD Bioscience), las células se incubaron con las mezclas maestras de anticuerpos en varias combinaciones que contenían los anticuerpos mencionados en la Tabla complementaria 9. Para la tinción intracelular de FoxP3, las células se permeabilizaron utilizando el conjunto de tampones de tinción de factor de transcripción/Foxp3 ( Thermo Scientific, ebioscience) y se incubaron con suero de rata normal (Thermo Scientific, ebioscience) antes de la incubación con el anticuerpo FoxP3. Para la cuantificación de los números absolutos de células, se utilizaron tubos BD Trucount (BD Bioscience) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se analizaron utilizando un citómetro de flujo LSRFortessa (Becton Dickinson and Company). La exclusión de dobletes se logró trazando áreas, alturas y anchos de dispersión hacia adelante y hacia los lados (FSC- y SSC-A/-H/-W). Los datos se analizaron con FlowJo v6.2 (Tree Star). La estrategia de activación se presenta en las figuras complementarias. 13–20. Para las pruebas de viabilidad celular, el perfundido se recogió al inicio de NMP, después de 1 h y al final de NMP (n = 5). Los glóbulos rojos se lisaron con tampón de lisis de RBC y los leucocitos se tiñeron con azul tripán. Se contaron por duplicado un mínimo de 150 células/muestra, se promediaron los resultados y se calculó el porcentaje de células vivas/muertas.

Se centrifugaron muestras de perfusión en serie de 26 hígados sometidos a NMP y se congelaron 500 µl de suero a -80 °C. Los niveles de proteína de citocinas/quimiocinas se midieron utilizando el Cytokine&Chemokine 34‐Plex Human ProcartaPlex Panel 1A (EPX340-12167-901, Thermo Fisher Scientific) en un instrumento Luminex MAGPIX (Luminex Corporation) y se analizaron mediante el software xPonent 4.2 Rev.2 (Luminex Corporation) según el protocolo del fabricante. El perfil de citoquinas se leyó según el tipo de donante (hígados DBD versus DCD) y el estado del trasplante (hígados trasplantados versus desechados).

Los datos del perfundido se expresan como valores absolutos o proporciones (%), promedios estimados ± desviación estándar (DE) e intervalo de confianza (IC) del 95 %. Se utilizó un modelo de efectos lineales mixtos para medidas repetidas (LMM) para la dinámica de la composición celular. Dada la distribución asimétrica positiva, se realizó una transformación logarítmica. Se utilizó ANOVA unidireccional para evaluar las diferencias considerando la perfusión general en el transcurso del tiempo. El análisis de expresión génica diferencial unicelular se realizó utilizando DESeq2 en muestras pseudomasivas agregadas por réplica biológica. Los análisis se realizaron utilizando el software estadístico R (v4.0.3, Team RC, R Foundation for Statistical Computing)98. Los gráficos se completaron utilizando GraphPad Prism 9.1.0 (216). Los valores de P para análisis no dirigidos (genes DE, TF, conjuntos de genes) se ajustaron mediante FDR. Los niveles de significancia y más detalles sobre las pruebas estadísticas se indican en los títulos de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuencia que respaldan los hallazgos de este estudio (todas las figuras) están disponibles a través del acceso NCBI GEO GSE216584. Todos los demás datos están disponibles en el artículo y sus archivos complementarios o del autor correspondiente previa solicitud. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código fuente para reproducir el análisis de datos está disponible en https://github.com/icbi-lab/nmp-liver. Los datos de entrada procesados ​​y las dependencias de software en contenedores necesarias para ejecutar el código están disponibles en zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.7249006.

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Descargar referencias

Los autores desean agradecer a Astrid Drasche y Annabella Pittl por el apoyo técnico y al DI Wolfgang Peter por el apoyo estadístico. La investigación fue apoyada por el Fondo Austriaco para la Ciencia FWF (Subvención No. TAI-697) (DW), “In Memoriam Gabriel Salzner Stiftung” (SS, DW), Tiroler Wissenschaftsfond (TH), Jubiläumsfonds—Österreichische Nationalbank (RO), Beca FFG Agencia Austriaca de Promoción de la Investigación, 858057 (HD FACS, S.So.). GS contó con el apoyo de una beca DOC de la Academia de Ciencias de Austria. La autora Margot Fodor (MF) utilizará parte de los materiales y datos de este estudio para completar su doctorado. tesis.

Estos autores contribuyeron igualmente: T. Hautz, S. Salcher, M. Fodor.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: D. Wolf, S. Schneeberger.

Departamento de Cirugía Visceral, de Trasplantes y Torácica, Centro de Medicina Operativa, Laboratorio organLife y Laboratorio de Investigación D. Swarovski, Universidad Médica de Innsbruck, Innsbruck, Austria

, T. Hautz , M. Fodor , S. Ebner , B. Cardini , J. Hofmann , T. Resch , F. Krendl , A. Weissenbacher , G. Otarashvili , D. Öfner , J. Troppmair , R. Oberhuber & S .Schneeberger

Departamento de Medicina Interna V, Hematología y Oncología, Centro Integral del Cáncer de Innsbruck (CCCI), Universidad Médica de Innsbruck, Innsbruck, Austria

S. Salcher, A. Mair, M. Trebo, G. Untergasser, S. Sopper, A. Martowicz, S. Daum, M. Kalb, A. Pircher y D. Wolf

Instituto de Bioinformática, Biocentro, Universidad Médica de Innsbruck, Innsbruck, Austria

G. Sturm y Z. Trajanoski

Tyrolpath Obrist Brunhuber GmbH, Zams, Austria

G. Untergasser, A. Martowicz y P. Obrist

Instituto de Patología, Neuropatología y Patología Molecular, Universidad Médica de Innsbruck, Innsbruck, Austria

B. Zelger

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Conceptualización y diseño del estudio (TH, RO, AP, DW, S.Sc.), recolección de datos (MF, BC, JH, TR, FK, AW, GO, RO, AP), secuenciación de sc-RNA realizada y datos analizados ( S.Sa., GS, GU, A.Mai., MT, S.So., MK), realizó análisis de citometría de flujo y analizó datos (SE, MF, TH, S.So.), realizó Luminex y analizó datos ( MF, TH), patología y análisis microscópicos (A.Mar., PO, BZ), visualización (S.Sa., MF, GU, A.Mar., SD, D.Ö., ZT, JT), escribió original borrador (TH, S.Sa., MF), revisión y edición final del artículo (todos). OR, PA, WD y SS contribuyeron igualmente como autores principales.

Correspondencia a D. Wolf o S. Schneeberger.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Damien Chaussabel y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Hautz, T., Salcher, S., Fodor, M. et al. Dinámica de las células inmunitarias desconvolucionada mediante la secuenciación de ARN unicelular en la perfusión del hígado con máquina normotérmica. Nat Comuna 14, 2285 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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Recibido: 22 de febrero de 2022

Aceptado: 27 de marzo de 2023

Publicado: 21 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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